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遗传与发育综合实验实验讲义


遗传与发育 综合实验 讲义

第一部分:分子标记技术系列实验:
实验一 RAPD标记 实验内容:1 DNA制备 3 实验二 SSR标记 2 PCR扩增 RAPD 结果检测统计分析

实验内容: 1 基因组DNA制备

2 微卫星DNA的

扩增 3 SSR标记检测分析 实验三 AFLP标记

实验内容:1 酶切与连接 3 银染 2 选择性扩增 4 目的DNA的回收

第二部分 植物基因克隆技术系列实验
实验一 利用RT-PCR技术分离目标cDNA片段
实验内容:1 cDNA合成 2 PCR扩增

3 筛选目标cDNA
实验二 mRNA差别显示技术

实验内容:1 RNA制备 2 逆转录
3 PCR差异显示mRNA

4. 测序胶分离PCR产物 5. 银染
6. 结果与讨论

第一部分 分子标记技术系列实验

? 遗传标记在遗传学的建立和发展中有着

举足轻重的作用,同时也是作物遗传育 种的重要工具。遗传标记主要分为: ? 形态标记、 ? 细胞学标记、 ? 生化标记 ? 分子标记。分子标记则是DNA水平遗传 变异的直接反映。

?DNA分子标记具有能对各发育时

期的个体、各个组织、器官甚至 是细胞作检测,既不受环境的影 响,也不受基因表达与否的限制; 数量丰富;遗传稳定;操作简便 等特点。广泛应用。

? DNA分子标记使得基因组作图工作

成了遗传学上描述细胞中所含遗传 物质的一个简单概念,已形成了一 门复杂的新兴学科—基因组学,其 影响之大不仅波及了生物学、医学 和农业的各个方面,而且对社会也 产生了巨大的冲击。

第一单元:RAPD标记
? RAPD(Random Amplified Polymorphic

DNA,其发音与英文字母“rapid”相同) 技术是由美国杜邦公司的Williams和加 里福尼亚生物研究所的Welsh于1990年同 时发展起来的。核心技术都是通过PCR进 行DNA扩增。

? RAPD的基本原理:通过DNA扩增片段

的多态性来检测DNA所发生的遗传变 异。RAPD以检测DNA的多态性为目的, 但它检查的不是限制性内切酶片段 的多态性,而是PCR扩增DNA片段的 多态性,这种多态性反映了不同个 体模板DNA的核苷酸变化。

? 多态性产生的原因:

–一,模板中引物结合区的核苷酸 变化导致扩增DNA片段多态性。 –二,扩增范围内的碱基插入、缺 失、DNA重排等核苷酸变化导致扩 增DNA片段多态性。

实验操作:

1. DNA制备
1)取50-200mg新鲜叶片,置液氮中研磨 成粉。 2 )将冻粉分配到两个 1.5 或 2.0ml 的离心 管中, 加入提取缓冲液900μl, 轻轻搅动, 。 3 )各加入 100μl SDS ,于 65℃水浴中保 温10-15min(间隔晃动2-3次)。

4)各加入160μl 5 mol/L KAc,充分混匀, 冰浴中放置30min。 5) 4℃下12000rpm离心15min。 6 )上清转入新离心管中,加入等体积的 氯仿/ 异戊醇,轻轻颠倒离心管数次,放 置片刻。 7)4℃下8000rpm离心10min。

8 )上清转入另一离心管中,加入 2/3 倍体 积 、 -20℃ 预 冷 的 异 丙 醇 , 混 匀 , 放 置 30min, 观察DNA沉淀生成。 9) 4℃下8000rpm离心10min,倾去上清液, 将离心管倒置于吸水纸上,控干上清液。 10 ) 用 80% 的 乙 醇 洗 涤 沉 淀 , 吹 干 1015min。

11 )加入 100μl TE 缓冲液充分溶解沉淀 (若溶解不好,可置 37℃水浴中保温, 促进溶解)。 12)加入2μl RNase酶液,于37℃保温1h。 13 )加入等体积的氯仿 / 异戊醇, 混匀, 放置几分钟后10 000rpm 5min, 重复一次。

14)转移并量出上清液体积,置新离心管 中, 加入1/5 倍体积的3mol/L NaAC, 混 匀,加入 2.5 倍体积的无水乙醇,轻缓混 匀,室温放置数分钟。 15)10 000rpm离心5-10min,按9)操作, 去尽上清液。 16)用80%乙醇洗涤沉淀2-3次,吹干。加 入10μl TE或dH2O溶解DNA,备用。

2. PCR扩增:
1) 在冰上做好针对不同 DNA 的 100 个 PCR 反应混 合液(加样次序如下): 水 1475μl 10×缓冲液 200μl 10×dNTPS 200μl 引物(20μmol/L) 20μl Tag聚合酶 5 μl 终体积 1900μl (分装100管) DNA(10-100ng) 每管1μl

2)将反应混合液等量分装到反应管中。 3)加入DNA或引物 4)盖上小管,放到PCR仪上。 5)进行PCR反应,采用3步PCR程序:
– a) 1个循环 94℃ 36℃ 1min 72℃ 1.5min – b)45个循环 94℃ 4min

1min

36℃ 72℃
– c)

1min 1.5min
72℃ 5min 4℃ 保存

3.RAPD 结果检测:
1)用1×TBE配2%琼脂糖凝胶。 2)PCR结束后,每个样品中加入4μl 凝胶 上样缓冲液。 每个泳道上样 20μl ,选择合适的相对分子 质量Maker(如λHindIII/EcoRI)。 3) 电泳。 4) 观察。

第三单元:SSR标记
? 在人类及动植物的基因组中,包括内含子、

编码区及染色体上的任一区域,均存在着 由1~6个碱基对组成的简单重复序列 (simple sequence repeats),简称SSR,又称之 为微卫星DNA (microsatellteDNA).研究表 明,在真核生物中大约每隔10~50kb就 存在1个微卫星,其主要以2个核苷酸为重 复单位,也有一些微卫星重复单位为3个核 苷酸,极少数为4个核苷酸或更多.

SSR较早应用于人类和哺乳动物的研究, 既可以作探针进行Southern分析,又可以 根据其序列设计引物进行PCR检测,是构 建遗传连锁图谱非常有效的分子标记。 另外,SSR标记在物种的起源和进化、 遗传多样性、遗传疾病的诊断、基因 表达等遗传和育种有关的研究领域中 有着广阔的应用前景.

? SSR标记因具有:①随机分布在整个基因

组中;②多态性高;③可通过PCR迅速测 定,重复性好;④技术难度低,实验成本较 低;⑤引物序列公开发表,易在各实验室中 广为传播使用等特点。

1.基因组DNA制备(略)。 注意:进行SSR分析时,要制备高分 子量(HMW)的基因组DNA。SSR标记虽 然对DNA的质量要求不是特别高,但要通 过加入蛋白酶和RNA酶消化去除其中的 蛋白质和RNA,同时严格避免不同DNA之 间的交叉污染.提取DNA后,测定浓度,并 稀释到10×10-9~20×10-9g/μL (10~20ng/μL),-20℃贮存备用。

2.微卫星DNA的扩增:反应总体积为25μL 包括: 10mmol/L TrisHCl pH8.3, 30 mmol/LMg2+ 25 mmol/LdNTP 0.4~10uDNA聚合酶 2μmol /LSSR引物 约100ng基因组DNA

? PCR扩增程序:

94℃ 5min 94℃ 30s 退火温度 30s 72℃ 1min 72℃ 5min

30cycle

3.SSR标记电泳检测:分3个主要环节。 ? 1)电泳: 采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,设恒定 功 率 , 预 电 泳 约 30min 后 , 加 扩 增 样 品 DNA4 ~ 6μ L, 电泳 40 ~ 60min( 视SSR分子量大小及差 异带的可辨度调整电泳时间)。 ? 2)染色: SSR PCR扩增产物电泳之后用银染法 来检测扩增产物,不仅可避免使用同位素,而且分 辨率很高,甚至能检测出1ng以下的DNA。 ? 3 )统计分析:观察带的有 ( 计为 1) 或无 ( 计为 0) 及相对位置,然后根据不同的研究目的,应用相关 软件进行分析。

第三单元:AFLP标记
? AFLP(扩增片断长度多态性 amplified

fragment lengment polymorphism)是一种 十分有效的DNA指纹图谱技术。1993年 由Zabean和Vos提出完善。 ? AFLP不仅是RFLP和PCR相结合的一种技 术,而且完善了RFLP和RAPD两种方法 的特长。

? 基本原理:对基因组DNA限制性酶

切片段进行选择性扩增,使用双链 人工接头与该酶切片段相连接作为 扩增反应的模板,在DNA聚合酶作 用下进行PCR反应。该技术的独特 之处在于人工设计合成了限制性内 切酶的通用接头以及可与接头序列 配对的专用引物,因此在不需要事 先知道DNA系列信息的前提下,就 可对酶切片段性传统的PCR扩增。

? 在检测AFLP时,先用内切酶酶解基因组

DNA,再将接头连接到限制性片段的两端, 然后用专用引物扩增连接后的限制性片段 的混合物,扩增结果通过电泳显示。 ? 一般采用两个限制性内切酶,一个酶为多 切点,另一个酶的切点较少,因而AFLP反 应过程中产生的主要是两个酶共同酶切的 片段。

? 此外,设计的专用引物除了核心碱基系

列和限制性内切酶识别序列外,引物的3’ 段引伸出1-13个数量不等的随机核苷酸 碱基,通过运用不同数量的这种碱基, 可以调节AFLP产物的条带特异性和数量, 从而提供较多的基因组多态性信息。

? 不同样品由于DNA序列不同,扩增出片

段数及长度各不相同,经变性的聚丙烯 酰胺凝胶电泳就能区分出不同样品的带 之间的差异,作为遗传标记构建连锁图, 或由于其独到的检测DNA多态性的方式, 已成为基因组研究的一个非常有用的工 具,与RFLP相比,它无需了解DNA模板 序列,产生的多态性较多,与RAPD相比, 它的可重复性得到极大提高。

AFLP技术的应用: ? 从AFLP技术建立以来,在植物研究领域已被 应用于许多方面,如:生物多样子性分析、建 立基因图谱、得当与农业性状对应的标志、用 于基因克隆等。作为分子标记技术应有以下要 求:稳定性好、分辨率高、多态性强、效率高。 ? 另外,AFLP的标志还可以进一步用于系谱分 类,通过各样品共有标志的多少,可以分出它 们之间的远近。

? AFLP最大的特点是能产生大量的DNA标

志,建立基因图谱,通过对它的分析, 人们可以了接导基因结构特点。 ? 到目前为止,已有几十种植物得到了大 量DNA标志。包括:向日葵、棉花、油 松、胡椒、小麦、大麦、马铃薯、水稻、 兰花、橡树、番茄、甜菜等。

? 本实验应用AFLP技术对特异物种的基因

组DNA进行分析,找出差异DNA条带并 作进一步分析。

实验操作
? 酶切与连接
模板 (50ng/ul) 接头 EcolⅠ (4u/ul) MseⅠ (4u/ul T4 DNA ligase (3u/ul) 2×PCR buffer ATP H2O 离心,混匀。 4ul 1ul 1ul 1ul 1ul 2ul 2ul(10mM) 8ul

– 程序: 30℃,4小时。8℃过夜。 在PCR仪 中运行。

? 预扩增

模板 引物 dNTP 10×PCR buffer Taq酶 (2u/ul) H2O 离心,混匀。

2ul 2×0.2ul 0.5ul 2.5ul 0.5ul 19.1ul

? 程序:

94℃ 94℃ 56℃ 72℃ 72℃

2 min 40 s 30 s 80 s 5min

30 Cycle

? 选择性扩增 预扩增产物按1:20稀释。稀释后的样品作 为选择性扩增的模板。 模板 2ul 引物(EcolⅠ和MseⅠ的引物各一种) 2×0.2ul dNTP 1ul 10×PCR buffer 5ul Taq酶 (2u/ul) 2ul H2O 39.6ul 离心,混匀。

? 程序: 94℃ 2min 94℃ 30s 65℃ 30s 72℃ 80s touch down 每轮0.7℃,共12轮。 94℃ 30s 55℃ 30s 72℃ 80s 扩增23轮。

? 银染

– 样品的准备:选择性扩增的产物与甲酰 胺上样缓冲液(98%甲酰胺, 10mMEDTA, 0.25%溴酚兰)2:1混匀, 95℃变性8分钟,立即冰浴,待用。 – 6%变性胶的制备、电泳

1、6%Arc/Bis胶贮液 尿素 420.42 g Arc 60g 定容到1L,过滤。 Bis 3.16g 4℃保存。 10×TBE 50ml
2、胶的制备 6%Arc/Bis 10%AP 10×TBE 50ml 250ul 50ul

3、玻璃板的消化及组装 洗净的玻璃板淋干,用95%的酒精冲洗2 遍,干燥。用吹风机预热玻璃板。分别向 两板上用擦镜纸涂300 ml剥离硅烷。通风厨 中干燥30分钟。组装。灌胶。
4、预电泳 向上槽液中加入0.5×TBE,下槽液中加入 1×TBE,300V电泳半小时。

5、上样、电泳
吹净加样孔中的尿素和气泡。上样。250V 电泳4小时。

? 银染 – 1、固定:10%的乙醇和0.5%冰醋酸固定6分钟,分两 次进行,可过夜 – 2、染色:0.2%硝酸银溶液中浸泡20分钟,时间可稍 长。 – 3、漂洗:蒸馏水充分漂洗。2-3遍。 – 4、显色:1.5%氢氧化钠和0.4%甲醛显色。预冷。 10℃最好。 – 5、终止:0.75%碳酸氢钠溶液。 – 6、胶可在固定液中保存几天。 – 7、也可制备干胶。制备前,将胶和剥离纸在5%的甘 油溶液中浸泡3小时。

? 目的DNA的回收用

– 刀片切取差异条带,置于Ep管中。加入 100ul双蒸水,室温静置10分钟。 – 煮沸15分钟。 – 高速离心2分钟。弃沉淀,留上清。 – 向上清中加入10 ul ,3mol/l,PH5.2,NaAc; 5ul,10mg/ml糖原;400ul,100%乙醇。混匀。 -70℃放置30分钟,或者-20℃更长时间。
– – – – 4℃高速离心10分钟。弃上清。 加入500ul,85%乙醇洗沉淀。 干燥,溶于10ul双蒸水。 取4ul进行PCR反应,其余-20℃保存。

第二部分 植物基因克隆 技术系列实验

第一单元:用差异显示法分离特异表 达的基因片段
差式显示(Differential display)是由 Liang和Pardee在1922年建立的一种新的 分子生物学技术,其目的就是对不同细胞 的mRNA进行比较,寻找特异表达的基因。 由于该方法简便直观,目前在动物、植物 中已有很多成功应用。

? 差式显示的基本策略是通过反转录与PCR扩

增mRNA中特定的一小部分,用DNA序列分 析胶(6%~8%polyacrylamide gel)同步分离 显示扩增产物以进行比较。 ? 首先,要以5’-T(n)MN-3’(3’固定引物, 3’anchored primer,其中n=10~20, M=dA/dC/dG, N=dA/dC/dT/dG)作引物,将待 比较的mRNA进行逆转录得到单链cDNA为模 板,由于该引物具有poly(dT),故可与mRNA的 3’-poly(A)结合,而另外两个碱基MN的作用 是使它定位在poly(A)的5’端,并使它只介导 约1/12的mRNA 的逆转录(为什么?)。

? 逆转录之后,以单链cDNA为模板,立即

进行PCR, 3’端就是上述3’固定引物,5’ 端引物是10~13个碱基的随机引物 (5’arbitrary primer)。对于在细胞A中 表达而不在细胞B中表达的基因来说,若 引物合适,就可能在A的PCR产物中发现 相应的基因片段,而不会在细胞B的PCR 产物中发现该片段。

? 由于5’端引物较短,特异性较低,能以相对较

高的机率与cDNA5’端结合,从而保证每一对 引物都能扩增出适当数量的DNA片段(约 50~150条)。若片段数过少,要对全部mRNA 进行比较就必须合成大量引物,进行大量PCR; 若片段数过多,又会增加分离纯化的难度,当 每次PCR扩增50~150个片段时,通过对12个3’ 引物和25个5’引物的不同组合,可以在95%的 情况下分析15 000个不同的基因,基本包括单 个细胞所能表达的全部基因数。

? 由于PCR的产物一般含有几十至上百个

分子量相近的DNA片段,所以需要用高 分辨率的测序胶(6%~8%的聚丙烯酰胺 凝胶)来分离这些片段。

? PCR产物分离后的显色,本实验采用银

染法。 ? 显色后我们会看到很多条带,其中大多 数是共有的,但在某些位置上会有特异 的条带,这些条带就是我们要找的特异 表达的基因片段。

? 银染法的原理是利用了DNA对银离子的

吸附作用,将吸附的银离子还原成金属 银,从而显示DNA条带的位置。其优点 是灵敏度高,显色快速简单,可在电泳 后几十分钟内得到结果。使用放射性同 位素虽可达到近似的灵敏度,但一般需 曝光几十小时以上,并且要求PCR中掺 入同位素,因此对防护的要求较高,使 操作复杂化。

? 银染法的缺点是必须将DNA固定在胶

上才能有好的染色效果,这就使得从 胶上回收特异的DNA片段进行后续实 验十分困难,所以在实际操作中并不 使用。

? 操作步骤 – 1. RNA制备 1)液氮研磨,材料剪碎直接放入研钵中,加入 少量液氮,迅速研磨,再加少量液氮,再研 磨,如此三次,按50-100mg组织/ml Trizol加 入Trizol,转入离心管进行第2步操作。 2)室温放置5min,使其充分裂解。 注:此时可放入-70℃长期保持。 3)12,000rpm 离心5min,弃沉淀。

4)按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿,振荡混匀后 室温放置15min。 注:禁用漩涡振荡器,以免基因组DNA断裂。 5)4℃ 12,000g离心15min。 6)吸取上层水相,至另一离心管中。 注:千万不要吸取中间界面。 7)按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀,室 温放置5-10min。 8)4℃ 12,000g离心10min,弃上清,RNA沉于管 底。

9)按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇,温和 振荡离心管,悬浮沉淀。 10) 4℃ 8,000g离心5min,尽量弃上清。 11)室温晾干或真空干燥5-10min。 注:RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解。 12)可用50ul H2O,TE buffer或0.5%SDS溶解 RNA样品,55-60℃,5-10min。 注:H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高 压。

? 2.逆转录: – 1)按下列方法建立四套不同的简并oligo(dT) 锚定引物(T7T12MG, T7T12MA, T7T12MC, T7T12MT) 5×RT buffer 4 ul dNTP1(1mM): 1 ul 总RNA: 0.2 ug(或mRNA0.1ug) T7T12MN: 1 ul 加水补足: 19 ul 离心数秒混匀。

– 2)65℃温育2min,37℃温育5min; – 3)加入1ul M-MLV(RNase H-)反转录酶, 离心数秒,37℃50min; – 4)95℃温育5min灭活反转录酶,稍加高速 离心以收集液滴,可立即用于PCR扩增, 或贮存于-20℃,用于下面实验。

? 3 PCR差异显示mRNA: – 1)对于每一套引物按以下方案准备20ul反 应液: 10×PCR buffer: 2ul dNTP2(0.2mM): 1ul T7T12MN: 1ul M13十聚体随机引物: 1ul cDNA(RT产物): 2ul Taq-plus: 0.5-1ul 加水补足: 20ul

– 2)离心数秒,按下列参数进行PCR扩增: 94℃ 预变性 2min 94℃ 变性 30秒 40℃ 复性 20秒 40循环 72℃ 延伸 60秒 72℃ 延伸加时 10min

? 4. 测序胶分离PCR产物 – 配胶:5.7g丙烯酰胺,0.3gN,N’- 甲叉双丙烯 酰胺 ,48 克尿素,放入 200mL 烧杯中,加入 20mL 5×TBE,20mL 重蒸水,搅拌溶解,由 于尿素溶解时吸热,故可将烧杯置于37℃水 浴促溶。待完全溶解后,定容至 100mL , Wattman 3MM滤纸过滤,然后于4℃避光保 存备用。 – 另外配置 10% 过硫酸铵溶液 0.5mL ,注意一 定要现用现配。

– 胶板的准备:将两块玻璃板洗净,蒸馏水冲 洗一遍,晾干。 – 用脱脂棉蘸2~3mL疏水硅化液在长方形玻璃 板上均匀涂抹至干,用装无水乙醇的洗瓶自 上至下冲洗一遍,冲掉未结合上的硅化液, 晾干备用。在凹形玻璃板上用亲水硅化液 5mL同法进行亲水硅化。 – 灌胶:在两块玻璃板之间两侧各夹上一个 0.4mm 厚 与 胶 板 等 长 的 塑 料 间 隔 片 ( spacer ),用胶布将三面封死,用铁夹夹 紧。

– 在100mL配好的聚丙烯酰胺凝胶贮液中加入 0.5mL10% 过 硫 酸 铵 , 轻 摇 混 匀 , 再 加 入 50μL TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二 胺),轻摇混匀,注意不起气泡。然后将立 起胶板,稍倾斜,将配好的胶沿玻璃板慢慢 倒入胶板间的空隙,注意不要再胶中留着气 泡。若已产生气泡,可将胶板适当倾斜以使 胶面降至气泡以下,气泡会自然破裂。倒满 胶厚,水平放置胶板,将梳子的平面插入两 板之间约4~5mm,用铁夹固定,静置1h左右 使胶聚合完全。

–上样:胶凝厚,撕去胶布,轻轻拨出,注意 不要损坏胶面。用注射器水冲洗胶面,洗掉 碎胶。反转梳子,将锯齿面插入两板之间, 使齿尖稍进入胶面(约0.5mm),数字齿之 间的间隙即是样品槽。把胶板固定在电泳槽 上,槽中加入1×TBE至没过胶面。用1 900V 预电泳20min,同时将样品于80~100℃加热 变性2min后立即置于冰上,使其保持单链状 态。停止预电泳,用注射器灌电泳液将胶面 上析出的尿素冲掉,即可开始上样。上样使 用微量进样器,每个样品取10μ 左右。 – 注意,每一对样品必须相邻并且同时电泳。

– 电泳:上完样后,立即开始电泳。电压 设为 1 900V 左右。电泳时注意不要使胶 的温度太高,必要时可将铁板夹在玻璃 板上帮助散热。电泳至第二道染料(二 甲 苯 菁 FF ) 即 将 出 胶 时 停 止 ( 一 般 需 2~4h )。放掉电泳液,取下胶板,将两 块板轻轻撬开,胶将会留在亲水硅化过 的板上。

? 5. 银染 – 拿胶板时应戴手套,拿胶板的边缘,以防止 指纹。 – 固定:胶面向上将胶板放入一个浅塑料盘中, 倒入固定液,使其没过胶面。轻轻摇晃 20min 左右至看不见胶上的染料时,将板取 出。注意回收固定液。 – 洗胶:用重蒸水浸泡胶板2min,取出后沥干 10~20s,换水浸泡。重复三次。 – 染色:将板转入染色液,轻摇30min。

– 显色(注意要严格控制各步的时间):
a:将3mL甲醛及400μL硫代硫酸钠(10mg/mL) 溶液加入10~20℃的显色液中。 b:从染色液中取出胶板,重蒸水中浸泡5~10s, 立即取出(若超出时间,须重复染色步骤)。 c:将胶板置于1L预冷的显色液中,充分振荡, 直至看见第一个条带,然后将胶板转至另1L 显色液中,继续显色2~3min,至其余条带清 晰可见。

– 终止显色:将回收的等体积固定液直接 倒入显色液中,摇2~3min终止显色。 – 清洗:用重蒸水浸泡两次,每次2min。 – 干燥:将胶板置于室温晾干。然后,在 浅色背景下即可进行观察。

? 结果与讨论

1. PCR是一种高度灵敏的DNA扩增反应, 它可把单个DNA分子扩增105倍以上。反 应体系中微量的 DNA 污染都可能对结果 产生很大的影响,因此在配制 PCR 反应 混合物时应非常小心,所用的 tip 头应是 灭菌的新 tip 头,每加一种试剂应换一个 头。模板 DNA 应最后加,以尽可能减少 污染的几率。

由于本实验要对两组 cDNA 进行比较, 所以二者的反应条件应尽可能相同,以 免引入虚假的差别。为达到此目的,有 必要在配制反应混合液时加以特别注意, 防止误差。最好的方法时将除模板外的 所有的反应成分共同配制成一份混合液, 再分装到两个管中,加入不同模板进行 反应。

2 .银染过程中染色后用水清洗的时间 非常重要,若过长则会使银离子与 DNA 脱离结果,从而使整个银染失败。

第二单元:利用RT-PCR技术分 离目标cDNA片段
? 操作步骤

– 1. cDNA合成 1) 在一个0.2mL的薄壁管中分别加入: 提取的总RNA 2-3μl Oligo(dT)15 1.0μl DEPC处理水 至5.0μl

2)70℃作用5 min, 立即冰浴5min. 3) 加入下列组分:
5 ×第一链反应Buffer 4.0μl MgCl2 2.4μl dNTP 1.0μl RNA酶抑制剂 20U 反转录酶 1.0μl DEPC处理水 至20μl

4) 25℃退火5min, 42℃合成60min, 70℃终止反应15min, 4℃保存。

– 2. PCR扩增
1) 在一个0.2mL的薄壁管中分别加入: 2×GC Buffer 10μl dNTP 3.2μl 5’上游引物 0.2μl 3’下游引物 0.2μl 模板cDNA 3.0μl TagDNA聚合酶 0.2μl DEPC处理水 至20μl

2)轻轻混匀,进行PCR扩增:
94℃ 94℃ 55℃ 72℃ 72℃ 3min 30s 2min 30s 10min

30个循环

– 3.筛选目标cDNA 电泳检测: 配制 1.0% 的琼脂糖凝胶,对 RT-PCR 产物 进行电泳分析,筛选目标条带,准备 回收。

回收程序:
1)切下凝胶置于Eppendorf管里,加水或TE到 600μl,70--80℃溶胶5分钟。 2)用TRIS饱和酚等体积抽提:12000rpm离心, 取上清于一个新的小管里。 3)酚仿等体积抽提,酚:仿:上清=1:1:2, 11000rpm离心, 取上清于l另一个新管里。 4 )氯仿与上清等体积抽提, 10000rpm 离心取 上清于一个新小管里。

5)上清中加入2倍体积无水乙醇,1/10体积 3 摩尔NaAC,-70℃沉淀30分钟或-20℃沉淀 1 小时。12000rpm离心弃上清,70%乙醇洗沉 淀,无水乙醇洗沉淀,吹干。 6)水溶15μl即为回收的片段。 7)目标cDNA回收片段电泳检测(略)


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